Language
Бусина

Блог

ДомДом / Блог / Бусина
search

Aug 05, 2023

6K Energy внедрит нанооборудование Forge Nano для промышленного производства катодов NMC 811

May 29, 2024

Бусина

Feb 14, 2024

О гранте Slurry Infrastructure, кто может подать заявку и за что он может заплатить

Nov 13, 2023

Передовые решения для шлифования на выставке EMO 2023

Jun 11, 2024

Аэробные тренировки и микробиом кишечника

Отправьте запрос
ПРЕДСТАВЛЯТЬ НА РАССМОТРЕНИЕ

May 29, 2024

Бусина

Коммуникационная биология, том 5, Номер статьи: 1206 (2022) Ссылаться на эту статью 3909 Доступ 4 Подробности Altmetric Metrics Анализ агонист-управляемого фосфорилирования рецепторов, связанных с G-белком

Биология связи, том 5, Номер статьи: 1206 (2022) Цитировать эту статью

3909 Доступов

4 Альтметрика

Подробности о метриках

Анализ управляемого агонистами фосфорилирования рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), может дать ценную информацию о состоянии активации рецепторов и фармакологии лигандов. Однако на сегодняшний день оценка фосфорилирования GPCR с использованием высокопроизводительных приложений является сложной задачей. Мы разработали и утвердили иммуноанализ на основе шариков для количественной оценки индуцированного агонистом фосфорилирования GPCR, который можно полностью проводить в многолуночных планшетах для культивирования клеток. Анализ включает иммунопреципитацию аффинно-меченных рецепторов с использованием магнитных шариков с последующим обнаружением белка с использованием антител против GPCR, специфичных и независимых от состояния фосфорилирования. В качестве доказательства концепции пять прототипических GPCR (MOP, C5a1, D1, SST2, CB2) были обработаны различными агонистами и антагонистами и были построены кривые концентрация-ответ. Затем мы расширили наш подход, чтобы провести анализы селективного ингибитора клеточной киназы GPCR (GRK), что привело к быстрой идентификации селективного ингибитора GRK5/6 (LDC8988) и высокоэффективного ингибитора пан-GRK (LDC9728). В заключение, этот универсальный анализ фосфорилирования GPCR может широко использоваться для профилирования лигандов и скрининга ингибиторов.

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются преобразователями жизненно важных сигналов, которые опосредуют эффекты различных химических и физических раздражителей и представляют собой основные мишени для лекарств при многих заболеваниях человека. GPCR имеют однородную структуру с семью трансмембранными доменами и поэтому их также называют семитрансмембранными рецепторами (7TMR). Активация их эндогенными лигандами или экзогенными агонистами приводит к конформационным изменениям GPCR, которые распознаются семейством киназ, называемых киназами рецепторов, связанных с G-белком (GRK)1. Уникальная способность GRK распознавать активированные рецепторы приводит к агонист-зависимому фосфорилированию внутриклеточных остатков серина и треонина2,3. Кроме того, в фосфорилировании GPCR могут также участвовать киназы, регулируемые вторым мессенджером, включая протеинкиназы A и C и другие серин/треониновые киназы4,5,6. Фосфорилирование GPCR является биологически и фармакологически важным процессом, который в первую очередь инициирует десенсибилизацию и интернализацию рецептора7,8. Фосфорилирование также увеличивает взаимодействие GPCRs с внутриклеточными адаптерными белками, такими как β-arrestins, что может запускать вторую волну передачи сигналов9,10,11,12.

Первоначальные исследования GPCR были основаны на радиоактивных анализах фосфорилирования цельных клеток, которые требуют высоких уровней радиоактивности и не могут использоваться для идентификации отдельных фосфорилированных остатков серина и треонина. Позже исследования были направлены на анализ фосфопротеомики, с помощью которого была получена ограниченная количественная информация13. В настоящее время преобладающий подход основан на антителах, которые специфически распознают фосфорилированное состояние GPCR14,15,16,17,18. Когда они доступны, фосфозитоспецифические антитела против GPCR являются отличными инструментами для определения временной и пространственной динамики фосфорилирования рецепторов, идентификации соответствующих киназ и фосфатаз, обнаружения активации рецепторов и составления профиля фармакологических свойств новых лигандов19,20,21,22. Однако фосфозитоспецифичные антитела преимущественно используются в методах иммуноблоттинга, которые технически сложны, ограничены небольшими размерами выборок и трудно поддаются количественному определению.

В фармацевтических и академических исследованиях часто требуются высокопроизводительные анализы для облегчения проверки больших химических библиотек. Хотя связывание рецептора, передача сигналов G-белка и рекрутирование арестина могут быть оценены с помощью доступных методологий, адекватные технологии для определения фосфорилирования GPCR в настоящее время недоступны. Поэтому мы были мотивированы воспользоваться преимуществами фосфозитоспецифичных антител против GPCR при разработке количественного иммуноанализа фосфорилирования, который можно полностью проводить в многолуночных планшетах для культивирования клеток и который подходит для приложений со средней и высокой производительностью (рис. 1). Поскольку этот анализ можно адаптировать практически ко всем семитрансмембранным рецепторам, его называют «анализом фосфорилирования 7TM».

95% confluency. The cells were cultured in the presence or absence of the agonist [D-Ala2,N-MePhe4,Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) and then lysed in detergent buffer containing protease and protein phosphatase (PPase) inhibitors. After plate centrifugation, lysates were transferred to U-bottom 96-well plates. MOPs were then immunoprecipitated using mouse anti-HA antibody-coated magnetic beads. After washing the beads under magnetic force, either phosphosite-specific rabbit antibodies that specifically recognized the S375-phosphorylated form of MOP (pS375-MOP) or antibodies that detected MOP in a phosphorylation-independent manner (np-MOP) were added to the cells (Fig. 2a). Primary antibody binding was then detected using commercially available enzyme-labeled secondary antibodies followed by addition of the respective enzyme substrate solution. The color reaction in DAMGO-treated wells was stopped when the optical density (OD) read at 405 nm reached 1.2, typically within 2 to 8 min. Under identical conditions, the OD of untreated wells was approximately 0.2, suggesting that DAMGO-induced S375 phosphorylation of MOP was specifically detected within the optimal dynamic range for 2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)-based enzyme immunoassay substrates (Fig. 2b). Omission of the magnetic beads or the primary or secondary antibodies or the use of untransfected cells resulted in OD readings of 0.2 or less. When DAMGO was added at different concentrations ranging from 10 nM to 10 µM in wells assayed using the anti-pS375-MOP antibody, we observed increasing OD readings with data points following the typical shape of a sigmoidal concentration–response curve (Fig. 2c). In contrast, all wells assayed using the anti-np-MOP antibody yielded an OD reading of ~0.8, independent of agonist exposure, indicating that all the MOPs had been identified (Fig. 2c). Next, we evaluated the effect of PPase inhibitors with both a pS375-MOP phosphorylation immunoassay and western blot assay with cells cultured in a multiwell plate. For the western blot analysis, cells were cultured and treated in 96-well plates as described and lysed in detergent buffer with or without PPase inhibitors. MOPs were immunoprecipitated with anti-HA magnetic beads. Immunoprecipitates were washed under magnetic force, and receptors were eluted from the beads into SDS-sample buffer by incubating the plates for 25 min at 43 °C. When these samples were immunoblotted with the anti-pS375-MOP antibody, a concentration-dependent increase in S375 phosphorylation was observed in samples cultured with PPase inhibitors but not in samples lysed without PPase inhibitors (Fig. 2d, top panel). When the blot was stripped and reprobed with the np-MOP antibody, similar levels of MOPs were detected in all the samples irrespective of the presence of PPase inhibitors or agonist exposure (Fig. 2d, bottom panel). For the in-well assay, cells were plated and grown, treated and lysed as in the western blot assay, except that the samples were directly immunoassayed in the plate. Similar to the results obtained by immunoblotting, the results of the assay performed with the anti-pS375-MOP antibody revealed a concentration-dependent increase in signal intensity only in the wells with PPase inhibitor-treated samples (Fig. 2e). In contrast, in wells assayed with the anti-np-MOP antibody, similar signals were observed independent of inhibitor or agonist treatment (Fig. 2f). Notably, a high degree of correlation between the concentration–response curves obtained through the immunoblot analysis and immunoassay was found (Supplementary Fig. 1). These results show that the addition of PPase inhibitors during cell lysis was an essential component of the assay. These results also show that anti-pS375-MOP antibody binding depended on agonist-induced receptor phosphorylation, which needed to be protected from PPase digestion during cell lysis. The anti-np-MOP antibody bound to receptors regardless of their phosphorylation status, and hence, using this antibody appeared to be a feasible means of controlling total receptor content./p>